파킨슨병의 in vitro 및 in vivo 모델에서 프로바이오틱스 제제 SLAB51의 효과

Vanessa Castelli1, Michele d'Angelo1, Francesca Lombardi1, Margherita Alfonsetti1, Andrea Antonosante1, Mariano Catanesi1, Elisabetta Benedetti1, Paola Palumbo1, Maria Grazia Cifone1, Antonio Giordano2,3, Giovambattista Desideri1, Annamaria Cimini1,3

1 라퀼라 대학교 생명, 보건 및 환경과학부, 67100 라퀼라, 이탈리아 2 시에나 대학교 의학생명공학부, 시에나, 이탈리아 3 템플 대학교 Sbarro 암연구 및 분자의학 연구소와 생명공학 센터, 필라델피아, PA 19122, 미국

접수: 2019년 12월 17일 승인: 2020년 3월 4일 게재: 2020년 3월 9일

https://doi.org/10.18632/aging.102927

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초록

파킨슨병은 운동 및 비운동 증상을 특징으로 하는 흔한 신경퇴행성 질환으로, 운동 증상이 나타나기 전에 장 기능의 이상이 나타날 수 있습니다. 현재까지 파킨슨병(PD) 관련 증상을 완화할 수 있는 치료법은 있지만, 이 질환의 발병과 진행을 조절할 수 있는 치료법은 없습니다. 장의 변화된 구성요소들은 중추신경계와 장신경계 사이의 양방향 시스템인 장-뇌 축에서 중요한 역할을 할 수 있습니다. 식이는 장-뇌 축 기능에 영향을 미치는 장내 미생물총의 구성을 변화시킬 수 있습니다. 선별된 프로바이오틱스 투여를 통한 장내 미생물군 복원이 보고되었습니다. 본 연구에서는 새로운 제제인 SLAB51의 PD에서의 효과를 조사했습니다. 우리의 연구 결과는 이 프로바이오틱스 제제가 in vitro 및 in vivo PD 모델에서 6-OHDA의 유해한 효과를 상쇄할 수 있음을 보여줍니다. 이 결과는 SLAB51이 PD의 예방이나 보조 치료제로서 유망한 후보가 될 수 있음을 시사합니다.

서론

신경퇴행성 질환의 병인은 아직 명확하지 않지만, 생활방식과 유전적 요인과 같은 다양한 요인들이 관여합니다[1]. 파킨슨병은 도파민성 신경세포의 소실과 루이소체라고 불리는 α-시누클레인의 세포 내 축적을 특징으로 하는 흔한 신경퇴행성 질환입니다[2]. 많은 연구들이 파킨슨병(PD)의 기저 메커니즘이 보호 기능과 유해 기능 사이의 불균형으로 특징지어지는 염증 경로와 산화 스트레스를 포함한다는 것을 보여주었습니다[3-5]. 또한, PD를 포함한 신경퇴행성 질환에서는 뇌유래신경영양인자(BDNF)와 같은 신경영양 지원이 감소된 것으로 보고되었습니다[6, 7].

신경염증과 산화 스트레스는 α-시누클레인 응집을 촉발하며, 이는 다시 전염증성 사이토카인과 활성산소종(ROS)의 더 강한 방출로 이어집니다[8, 9]. PD 병리는 흑질에서 시작되는 것으로 알려져 있지만 장신경계도 포함할 수 있어, 장과 중추신경계(CNS) 사이의 상호작용을 강조합니다[10-12]. 임상적으로, PD 환자들은 떨림, 경직, 자세 불안정성, 운동완서와 같은 운동 증상을 보이며, 이는 우울증, 장 기능 이상, 통증, 후각 저하와 같은 비운동 증상을 동반하는데, 이러한 증상들은 운동 증상이 나타나기 전에 발현될 수 있습니다[13-15].

장의 변화된 구성요소들은 CNS와 장신경계 사이의 양방향 시스템인 장-뇌 축에서 중요한 역할을 할 수 있습니다. 식이는 장-뇌 축 기능에 영향을 미치는 장내 미생물총의 구성을 변화시킬 수 있습니다[12, 16]. PD 환자의 장관은 염증 매개체와 박테리아가 점막을 통과하여 혈액으로 침투하는 "누출성 장"으로 알려진 장 투과성 증가를 유발하는 전염증성 미생물총의 특징을 보입니다[17]. 또한, 장의 도파민성 신경세포 소실은 전염증성 사이토카인의 발현 증가를 유발합니다[18]. PD 환자의 장관은 건강한 개인과 비교하여 Prevotellaceae의 감소와 Enterobacteriaceae의 증가를 보이는 등 다른 장내 미생물총을 보이며[12, 19, 20], 이러한 장내 미생물 불균형은 중증 PD 표현형에서 더욱 뚜렷합니다.

장내 미생물군의 복원이 PD 진행을 억제하는 것으로 보고되었으며, 이러한 효과는 프로바이오틱스, 프리바이오틱스 및 심바이오틱스 제제, 대변 미생물총 이식 또는 줄기세포 이식을 통해 달성될 수 있습니다[21-23].

프로바이오틱스 제제는 사이토카인 생산을 통해 염증을 감소시키고[24], ROS의 감소를 통해 산화 스트레스를 감소시킬 수 있습니다[25]. 이는 감염이 있을 때 PD 진행이 가속화된다는 점에서 매우 중요합니다[26]. 기존의 프로바이오틱스 제제인 DSF가 노화 동물의 대뇌피질에서 다양한 유전자의 발현을 조절하여 염증을 감소시키고 신경세포의 기능을 향상시킬 수 있다는 것이 입증되었습니다[27]. 최근에는 새로운 프로바이오틱스 제제(SLAB51)가 알츠하이머병(AD) 마우스 모델에서 연구되어 인지 장애의 완화, Aβ 응집체와 뇌 손상의 감소, 그리고 변형된 신경세포 단백질분해 경로의 부분적 회복을 보여주었습니다[28]. 같은 연구 그룹은 SLAB51 치료가 SIRT1-의존적 메커니즘을 통해 AD 마우스 뇌에서 강한 산화 감소를 일으킨다는 것을 보고했습니다[29].

이러한 배경에서, 본 연구의 목적은 PD에서 SLAB51 제제의 효과를 조사하는 것이었습니다. 이를 위해, 우리는 먼저 PD의 in vitro 모델에서 이 제제를 테스트했고, 흥미로운 데이터를 얻은 후 도파민성 신경세포 분석과 행동 테스트를 통해 SLAB51의 잠재적 치료 효과를 in vivo에서 조사했습니다.

결과

In vitro

프로바이오틱스 제제 SLAB51이 신경보호 성분을 포함하고 있는지 조사하기 위해, PD의 in vitro 모델을 개발하고, 신경보호 및 신경세포 사멸 경로를 분석했습니다. 방법 섹션에 설명된 SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 도파민성 표현형 유도는 위상차 현미경, 티로신 수산화효소(TH) 발현, 도파민 생산 및 면역형광으로 분석되었습니다(그림 1). 레티노산(RA)/포르볼 에스터 12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(TPA) 처리 후, 세포들이 신경세포 형태를 보이고, TH의 발현 수준이 증가하며, 도파민을 생산하고, β-튜불린 III와 성장 관련 단백질-43(GAP-43)과 같은 신경세포 표지자를 발현하는 것을 관찰할 수 있습니다.

세포 생존율의 유의한 감소를 유도하는 6-히드록시도파민(6-OHDA)의 농도는 MTS 분석으로 평가되었습니다(표시되지 않음). 이를 바탕으로, 이 용량에서 50%의 사망률을 얻었기 때문에 후속 실험을 위해 35 μM 6-OHDA가 선택되었습니다.






SLAB51 용해물은 분화된 SH-SY5Y에 대한 세포 생존율 테스트에서 입증된 바와 같이 독성 효과를 보이지 않았습니다. 따라서 이러한 예비 결과를 바탕으로, 후속 실험을 위한 테스트 농도로 0.1 mg/ml의 추출물이 설정되었습니다. 그림 2에서 35 μM 6-OHDA와 SLAB51로 처리된 세포의 MTS 분석이 나와 있습니다. 명백히, 6-OHDA는 50%의 사망률을 초래했지만, SLAB51은 6-OHDA로 유도된 손상을 상쇄하고 대조군 조건을 회복시킬 수 있었습니다.

신경보호와 신경세포 생존에 BDNF 경로가 관여한다는 점을 주목할 만한데, 우리는 먼저 웨스턴 블롯을 통해 성숙 BDNF(mBDNF), 인산화된 티로신 수용체 키나아제 B(p-TrkB), 인산화된 cAMP 반응 요소-결합 단백질(p-CREB) 및 인산화된 세포외 신호-조절 키나아제 5(p-ERK5)의 단백질 수준을 분석했습니다. 6-OHDA 존재 시, mBDNF와 그의 특이적 수용체 TrkB 및 생존 키나아제 ERK5는 대조군 신경세포와 비교하여 유의하게 감소했지만, SLAB51의 존재는 대조군 수준을 회복시켰습니다(그림 3). 이는 프로바이오틱스에 의해 발휘되는 보호 작용을 시사합니다. 또한, mBDNF 수준과 생존 경로 포스포이노시티드 3-키나아제(PI3K)/인산화된 단백질 키나아제 B(p-Akt)를 조절하는 것으로 알려진 p-CREB는 6-OHDA에 의해 극적으로 감소했으며 SLAB51에 의해 대조군 수준으로 회복되었습니다(그림 3).

마지막으로, 신경세포 생존과 CREB 인산화에 관여하는 PI3K/Akt 경로와 시냅스후밀도 단백질 95(PSD95)는 6-OHDA에 의해 강하게 하향 조절되었지만, SLAB51의 존재는 이러한 효과를 상쇄했습니다(그림 4). 이는 용해물이 신경세포의 시냅스 가소성과 신경세포 생존을 개선할 수 있음을 시사합니다.

pro-BDNF, 인산화된 c-Jun N-말단 키나아제(p-JNK), 인산화된 세포외 신호-조절 키나아제(p-ERK1,2) 및 P75를 포함하는 신경세포 사멸 경로를 분석했습니다. 이러한 단백질들은 모두 6-OHDA에 의해 유의하게 증가했지만, SLAB51의 존재는 대조군 조건을 회복시켰으며, 이는 프로바이오틱스에 의한 신경보호 역할을 다시 한 번 확인해주었습니다(그림 5).

최근의 증거는 활성화된 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 γ(PPARγ)가 PD를 포함한 다양한 병리에서 BDNF 수준을 조절하는 데 관여한다고 보고했습니다[30]. 따라서, 지금까지 수집된 결과들을 바탕으로, 우리는 웨스턴 블롯 분석을 통해 PPARγ 수준을 측정했습니다. 실제로, 6-OHDA 처리 세포에서 전사 인자의 유의한 감소가 나타났습니다. 반면 SLAB51 용해물은 PPARγ 단백질 수준을 증가시켰습니다(그림 6). 또한, 신경퇴행 과정에서 발생하는 것처럼 산화 스트레스 동안 일반적으로 증가하는 지질 과산화의 산물인 4-히드록시노네날(4-HNE)이 증가한다는 것이 알려져 있으며, 프로바이오틱스가 6-OHDA 산화 손상을 상쇄하는 잠재적 역할을 강조하기 위해, in vitro 샘플에서 웨스턴 블롯으로 4-HNE 단백질 부가물을 분석했습니다. 프로바이오틱스 제제가 4-HNE 단백질 부가물의 수준을 유의하게 감소시켰음을 관찰할 수 있으며, 이는 SLAB51이 산화 손상에 대해 보호 역할을 한다는 것을 시사합니다(그림 6). 위의 유망한 in vitro 결과를 얻은 후, 이 제제가 더 복잡한 모델에서 신경보호 경로를 조절할 수 있는지 평가하기 위해, 우리는 일측성 6-OHDA-병변 동물 모델에서 프로바이오틱스를 테스트했습니다.

In vivo

제제를 in vivo에서 테스트하기 위해, 음용수에 희석된 SLAB51을 6-OHDA 주입 2주 전부터 매일 경구 투여하고 추가로 3주 동안 관찰했습니다("재료 및 방법" 섹션과 타임라인 그림 7A에 표시된 대로, 총 5주). 프로바이오틱스 제제의 경구 투여는 대조군과 처리군 마우스에서 사망률이나 평균 체중의 유의한 차이를 유발하지 않았습니다(그림 7B). 그림 7B에는 행동 테스트도 나와 있습니다. 특히, CNS 질환의 설치류 모델에서 운동 비대칭을 평가하는 데 사용되는 실린더 테스트는 선조체 병변이 마우스의 운동 수행능력에서 강력하고 유의한 감소를 유발했음을 보여주었으며, 특히 반대측 발의 사용 감소가 관찰되었습니다. 흥미롭게도, SLAB51은 6-OHDA 투여로 유도된 행동 장애를 상쇄하여 대조군 조건을 회복시킬 수 있었습니다.

Elevated Body Swing Test(EBST), 약물이 없는 상태에서 반파킨슨 모델의 비대칭적 운동 수행의 지표가 같은 그림에 나와 있습니다. 6-OHDA-병변 마우스는 대조군 동물과 비교하여 70% 이상의 오른쪽 편향 스윙을 보였지만, 프로바이오틱스 제제 치료는 이러한 효과를 상쇄할 수 있었습니다. 실제로, 2주차에 동물들은 SHAM 그룹과 동일한 행동을 보였습니다. 이러한 결과들은 운동 장애와 기능적 개선을 모니터링하는 도구인 아포모르핀 테스트에 의해 확인되었습니다[31]. 특히, 도파민(DA) 수용체 작용제 아포모르핀(APO)은 탈신경된 선조체에서 과민성 DA 수용체를 후시냅스적으로 작용하고 과자극함으로써, 동물이 병변 측의 반대쪽 방향, 즉 병변에서 멀어지는 방향으로 회전하게 합니다. 실제로, 우리의 실험 조건에서 6-OHDA 처리 마우스는 반대측 회전이 증가했지만, 프로바이오틱스 제제로 치료한 6-OHDA 마우스는 SHAM 그룹과 유사한 행동을 보였습니다(그림 7).

또한, 도파민성 신경세포에서 TH의 면역염색을 수행했습니다. 6-OHDA 처리 동물에서 TH 면역반응성의 현저한 감소를 관찰할 수 있었지만, SLAB51은 흑질과 선조체(CPu) 모두에서 도파민성 신경세포를 회복시켰습니다(그림 8). 이러한 데이터를 추가로 검증하기 위해, 마우스 흑질에서 도파민 수송체(DAT)에 대한 면역형광 분석을 수행했습니다. 그림 9에서 보고된 바와 같이, 6-OHDA 투여(오른쪽)에서 DAT 형광 강도의 대량 감소가 관찰되었지만, 프로바이오틱스 제제는 이러한 효과를 상쇄했으며, 이는 SLAB51이 신경보호 활성을 발휘했음을 시사합니다.

최근 연구들은 PD에서 신경염증과 미세아교세포 활성화를 입증했습니다[30]. 이러한 이유로, 뇌 절편에서 미세아교세포 활성화의 특이적 표지자인 미세아교세포 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1(Iba1)과 성상아교증의 표지자인 아교섬유산성단백질(GFAP)에 대한 면역형광 분석과 정량을 수행했습니다(그림 10). 6-OHDA 절편에서 Iba1과 GFAP 형광 강도의 유의한 증가를 관찰할 수 있었지만, SLAB51은 6-OHDA로 유도된 효과를 상쇄할 수 있었으며, 이는 신경염증의 감소를 나타냅니다.

이를 바탕으로, 신경염증, 산화 스트레스 및 에너지 대사에 관여하며 신경영양인자(BDNF 포함)의 방출을 자극할 수 있는 리간드 의존적 전사 인자 PPARγ[30]를 뇌 절편에서 면역형광으로 분석했습니다(그림 11). 흥미롭게도, SLAB51 처리 샘플은 핵 수준에서 전사 인자를 보여주었지만, 6-OHDA 처리 동물에서는 PPARγ에 대한 형광 강도가 크게 감소했으며, 더욱이 세포질 수준에서 위치했습니다. PPARγ에 대한 웨스턴 블롯 분석(그림 12)은 6-OHDA/SLAB51 처리 동물에서 이 단백질 수준이 대조군 수준으로 회복되었음을 보여주었습니다. PPARγ가 핵 내에 위치한다는 웨스턴 블롯 결과는 그의 활성화가 BDNF 경로를 통한 신경보호와 감소된 신경염증에 책임이 있을 수 있음을 시사하며, 이는 in vivo 샘플에서 수행된 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었습니다. 실제로, BDNF와 그의 수용체 TrkB는 PPARγ와 동일한 행동을 보여, SLAB51이 흑질과 선조체 모두에서 독소로 유도된 병변을 상쇄할 수 있었음을 시사합니다(그림 12).

최근의 연구는 헴옥시게나아제-1(HO-1)이 PPARγ의 상위 조절인자들에 의해 조절된다는 것을 보여주었습니다[32]. 확립된 세포보호 효과를 가진 항산화 효소 HO-1은 PD를 포함한 여러 병리적 과정을 조절하는 것으로 입증되었습니다. 특히, HO-1은 신경영양인자의 방출, 흑질의 도파민성 신경세포 생존 유지, 그리고 α-시누클레인 응집 예방에 관여합니다[33]. 흥미롭게도, 우리의 실험 조건에서 6-OHDA는 HO-1을 유의하게 감소시켰지만, 프로바이오틱스 제제는 6-OHDA의 효과를 상쇄하여 HO-1의 수준을 대조군 조건으로 되돌릴 수 있었습니다(그림 13에 나타남).

또한, 핵 전사 인자-적혈구 2 관련 인자(Nrf2)는 HO-1 프로모터 영역에 존재하는 항산화 반응 요소(ARE)에 결합할 수 있습니다[34]. Nrf2 활성은 노화와 함께 감소하며 PD의 주요 위험 요인 중 하나를 나타냅니다. 실제로, Nrf2의 증가는 산화 스트레스 손상을 상쇄함으로써 도파민성 신경세포를 보호합니다[35]. 그림 13에서 보여지듯이, p-Nrf2(전사적으로 활성화된) 단백질 수준은 6-OHDA 손상을 입은 동물에서 유의하게 하향 조절되었지만, SLAB51은 흑질과 선조체 모두에서 6-OHDA의 효과를 상쇄할 수 있었습니다.

또한, NRF2-ARE 시스템은 세포 생존과 사이토카인 방출에 관여하며 신경퇴행성 및 신경염증성 상태와 관련된 단백질 복합체인 핵 인자 카파-경쇄-활성 B 세포 증강자(NF-ĸB)와 상호작용합니다. 실제로, 우리의 실험 조건에서 NF-ĸB 단백질 수준은 6-OHDA 처리 시 상향 조절되었지만, 프로바이오틱스 치료는 흑질과 선조체 모두에서 이 단백질을 대조군 조건으로 되돌렸습니다(그림 13). 이는 신경 염증과 면역 반응의 조절을 시사합니다.

마지막으로, SLAB51의 잠재적인 생존 촉진 효과를 확인하기 위해, 흑질의 도파민성 신경세포에서 세포사멸 촉진을 TUNEL 분석으로 분석했습니다. 그림 14에서 보고된 바와 같이, 세포사멸은 6-OHDA 처리에서 극적으로 증가했지만, 프로바이오틱스 혼합물의 존재는 세포사멸 핵 지수를 약 10%까지 감소시켰습니다. 이는 프로바이오틱스 제제가 6-OHDA로 매개되는 세포사멸로부터 보호한다는 것을 시사합니다.

토의 및 결론

파킨슨병은 운동 및 비운동 증상을 특징으로 하는 흔한 신경퇴행성 질환으로, 운동 증상이 나타나기 전에 장 기능의 이상이 나타날 수 있습니다[13]. 분자적 관점에서, PD의 기저 메커니즘은 증가된 산화 스트레스와 염증을 포함합니다[1]. 현재까지, 이용 가능한 치료법은 PD 관련 증상을 완화하는 데 도움이 될 수 있지만, 이 질환의 발병과 진행을 조절할 수 있는 치료법은 없습니다.

증가하는 증거들은 프로바이오틱스의 사용이 장-뇌 축[36]을 통해 장내 미생물총을 변화시켜 CNS 질환에 긍정적인 영향을 미칠 수 있으며, 면역, 신경, 염증 및 호르몬 신호전달[37]과 같은 많은 경로를 매개할 수 있다고 보고하고 있습니다.

프로바이오틱스는 장에 서식하는 살아있는 미생물로, 숙주에게 유익하며 특정 질병을 예방합니다[38]. 최근에는 비피도박테리아와 락토바실러스의 혼합물인 SLAB51을 사용하여 장내 미생물총을 조절하는 것이 다양한 신경 경로에 영향을 미쳐 알츠하이머병의 진행을 지연시킬 수 있다고 보고되었습니다[28].

이러한 배경에서, 우리 연구의 목적은 PD에서 SLAB51 제제의 효과를 조사하는 것이었습니다. 이 제제의 효과는 먼저 6-OHDA in vitro 모델에서 연구되었습니다.

신경퇴행성 질환에서는 PD를 포함하여 신경영양 지원이 감소된 것으로 보고되었습니다[6, 39]. 신경영양인자군의 일원인 BDNF는 도파민성 신경세포의 생존과 분화를 유지합니다. In vitro에서 BDNF는 도파민성 신경세포의 사멸을 상쇄하여, PD를 위한 신경보호 치료적 접근법 개발에서의 잠재적 사용을 시사했습니다[40]. 이에 따라, 우리의 in vitro 연구는 프로바이오틱스 제제 SLAB51이 BNDF 경로를 조절하여 신경보호 단백질 수준을 증가시키고 신경세포 사멸 단백질을 감소시킨다는 것을 보여주었으며, 이는 프로바이오틱스에 의해 발휘되는 신경보호 효과를 확인해주었습니다.

따라서, 우리는 행동 테스트를 평가하여 프로바이오틱스를 in vivo에서 조사했으며, 흥미롭게도 SLAB51은 6-OHDA의 해로운 효과를 상쇄할 수 있었습니다. 치료적 접근법을 사용한 행동적 이점은 도파민성 수용체의 직접적인 자극이나 6-OHDA 독성으로부터 도파민성 신경세포를 보호함으로써 달성될 수 있습니다. 면역조직화학 결과를 바탕으로, 우리는 흑질의 도파민성 신경세포 소실에 대한 직접적인 보호가 관여하여 흑질-선조체 경로를 보호한다고 제안할 수 있습니다.

면역형광으로 검출된 SLAB51의 항염증 활성 외에도, 프로바이오틱스의 항산화 활성도 지질 과산화의 감소가 시사하는 바와 같이 in vivo에서의 신경보호 효과에 기여할 수 있습니다. Nrf-2는 내인성 항산화 시스템을 통해 세포 산화환원 상태를 조절하고 동시에 항염증 효과를 가지는 PD 병인에 관여하는 전사 인자입니다. HO-1은 Nrf2-매개 NFκB 억제의 핵심에 있는 Nrf2 표적 유전자입니다[41]. 실제로, 우리의 in vivo 실험에서 테스트된 프로바이오틱스 제제는 6-OHDA로 유도된 기능장애를 상쇄하여 Nrf2/HO-1 경로의 활성을 재확립하고 NFκB를 억제할 수 있었습니다. 이에 일치하여, 리포폴리사카라이드로 유도된 진행성 신경퇴행 마우스 모델에 대한 최근 연구에서, 알려진 PPARγ 작용제인 피오글리타존의 치료는 NFκB를 감소시키면서 Nfr2와 HO-1을 증가시킬 수 있었습니다[33]. 이는 산화 스트레스와 신경염증을 상쇄하는 데 있어 활성화된 PPARγ의 중추적 역할을 뒷받침합니다.

이 연구에서 사용된 두 모델이 매우 다르다는 점에 주목할 필요가 있습니다. 특히, in vivo 모델은 임상 조건과 가장 유사한 모델인 반면, in vitro 모델은 단일 도파민성 신경세포에서 일어나는 일을 분석하는 데 유용한 격리된 모델입니다. 그러나 우리가 두 모델에서 거의 동일한 결과를 얻었다는 것은 흥미롭습니다. 공통 분모가 PPARγ일 수 있다고 추측할 수 있는데, 이는 in vivo와 in vitro 모두에서 박테리아 대사의 일부 산물이나 유도체에 의해 활성화될 수 있습니다. 이러한 방식으로, 활성화된 PPARγ는 항염증 및 항산화 활성뿐만 아니라 BDNF와 그의 생존 경로의 증가를 촉발할 수 있습니다.

우리의 in vivo 연구는 프로바이오틱스 투여가 도파민성 신경세포를 보호하고 행동 장애를 개선할 수 있음을 보여주었습니다. 이 새로운 프로바이오틱스 제제는 또한 PD의 특징인 신경염증과 산화 스트레스를 상쇄하여, in vivo와 in vitro 모두에서 일부 기저 분자 경로를 대조군 조건으로 되돌릴 수 있었습니다.

전반적으로, 우리의 연구 결과는 SLAB51을 PD 예방이나 치료 또는 보조 요법을 위한 유망한 후보로 제시하며, 장내 미생물총의 조절이 다양한 생존 경로에 영향을 미쳐 잠재적으로 PD 진행의 지연으로 이어질 수 있다는 것을 확인해줍니다. 추후 연구에서는 증폭 시퀀싱 방법이나 마이크로어레이 상의 혼성화를 통해 PD 그룹과 프로바이오틱스 치료 그룹의 미생물총 구성을 분석할 필요가 있을 것입니다.


재료 및 방법

시험관 내 실험

SLAB51 박테리아 용해물 제조

SLAB51 제제(Sivomixx, Mendes, Switzerland) 1g을 10ml의 인산염 완충 식염수(PBS, Euroclone, UK)에 현탁하여 박테리아 용해물을 제조하였다. 이는 원심분리 및 초음파 처리 과정을 거쳤으며, 마지막 단계에서는 [42]에서 이전에 기술한 바와 같이 남아있는 전체 박테리아를 제거하기 위해 여과하였다.

MTS 분석

세포 생존능을 테스트하기 위해, 제조사의 지침에 따라 Cell Titer Cell Proliferation 키트(Promega Corporation Madison, USA)를 사용하였다. 포마잔 생성에 의존하는 생존능 지표는 ELISA 리더인 Infinite F200(Tecan, Swiss)을 사용하여 평가하였다. 테스트는 4회 반복 수행되었다. 결과는 492nm에서의 흡광도로 보고되었다.

시험관 내 모델

인간 SH-SY5Y 세포주는 ECACC에서 구입하여 37°C, 95% O2 및 5% CO2 인큐베이터(Thermo, USA)에서 10% 열 비활성화 FBS와 1% 페니실린/스트�프토마이신(Corning, USA)이 첨가된 Dulbecco's minimum essential medium에서 배양하였다. PD 시험관 내 모델을 위해, SH-SY5Y 세포주는 all trans-레티노산(10mM)과 3일간 포르볼(80nM)로 분화시켰다. 6 DIV에서 세포들은 2시간 동안 SLAB51 0.1 mg/ml 추출물로 처리한 후 24시간 동안 6-OHDA(Sigma Aldrich, USA)(35μM)를 첨가하였다. 모든 실험은 19번째 계대에서 수행되었으며 세포 배양은 마이코플라스마 존재 여부를 테스트하였다(Mycoplasma PCR, abm, USA).

면역형광

위에서 설명한 대로 세포를 배양한 후, PBS에서 4% PFA로 15분간 고정하고 -20°C에서 CH3OH로 7분간 투과처리하였다. 세포는 4% BSA(Sigma Aldrich, USA)에서 30분간 배양한 후, 4°C에서 다음의 1차 항체들과 함께 밤새 배양하였다: rabbit polyclonal anti-β-Tubulin III (1:1000 Abcam, Cambridge, UK), rabbit polyclonal anti-TH (1:200, Novus Biologicals, Centennial, USA), mouse monoclonal anti-GAP43 (1:200, Abcam, Cambridge, UK). 여러 번 세척 후, 커버슬립을 실온에서 1시간 동안 이차 항체인 goat anti-mouse 또는 anti-goat IgG Alexafluor 488 또는 633 또는 546 (1:2000 Life Technologies, California, USA)와 함께 배양하였다. 여러 번 세척 후, DAPI가 포함된 Vectashield mounting(Vector Laboratories Burlingame, USA)을 사용하였다. 모든 샘플은 공초점 레이저 현미경(Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 관찰하였다.

Western blotting

대조군과 처리군 세포를 수집하여 이전에 설명한 대로 용해하고 단백질 양을 평가하였다[43, 44]. 30 μg의 단백질을 로딩하여 running buffer에서 100 mV로 70분 동안 precast 4-20% gradient Bis-Tris gel에서 분리한 후, semi-dry 장치(Thermo scientific, UK)를 사용하여 PVDF 막으로 이전하였고, 30분 동안 5% 무지방 우유로 블로킹하였다. 막은 다음의 1차 항체들과 함께 밤새 배양되었다: anti-p-AKT (1:1000), anti-PI3K (1:1000 Cell Signaling, USA), anti p-CREB (1:500 Cell Signaling, USA), anti-pTrkB (1:2000 Cell Signaling, USA), anti-mBDNF (1:500 Abcam, UK), anti-pJNK (1:1000 Santa Cruz, USA), anti-p75(1:1000 Abcam, UK), anti-pro-BDNF(1:1000 Millipore, USA), anti-pERK5 (1:1000 Cell Signaling, USA), anti p-ERK1,2 (1:1000 Santa Cruz, USA). 여러 번 세척 후, 막을 1:10000 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG 또는 anti-mouse IgG와 배양하였다. 단백질 밴드를 검출하고, actin(housekeeping)으로 정규화하여 분석하였다. Anti-β-actin (HRP-conjugate) (1:10000)이 사용되었다. 재탐지를 위해, 막은 제조사의 지침에 따라 Restore stripping buffer(Thermo Scientific, UK)로 스트립핑하였다.

생체 내 실험

실험동물

동물 취급 및 수술 절차는 European Communities Council(Directive 2010/63/EU, prot #542/2019-PR)의 윤리 규정에 따라 불편과 통증을 최소화하도록 수행되었다.

6-OHDA 병변 실험을 위해, Charles River(Massachusetts, USA)에서 구입한 9주령 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 실험동물(n=30)은 12시간 명/12시간 암 주기로 물과 사료를 자유롭게 공급받으며 환기 케이지(Tecniplast, Germany)에서 사육되었다. 이전에 보고된 대로[45] 정위 고정(Stoelthing, USA)을 이용한 6-OHDA 주입을 수행하였다. 간단히 설명하면, 마우스를 마취(xylazine (10 mg/kg)과 ketamine (200 mg/kg))한 후 0.2% L-ascorbic acid(Sigma Aldrich, USA)가 포함된 생리식염수에 4 μg의 6-OHDA를 용해하거나 0.2% L-ascorbic acid가 포함된 생리식염수(SHAM group)를 선조체의 우측 영역(bregma 기준 좌표: medial-lateral +0.18 cm; anteroposterior + 0.04 cm; dorsal-ventral +0.35 cm)에 single syringe nano Infusion KDS 310(KD Scientific, USA)을 사용하여 0.5 μl/minute의 속도로 주입하였다. 주입 후 제거하기 전에 5분간 기다렸다.

처리

SLAB51 제제는 Mendes Sa(Switzerland)에서 제공받았다. SLAB51은 1개의 sachets(1.5g/2000억 박테리아)를 10ml의 음용수에 용해하여 신선하게 준비하였고, 처리군 마우스는 경구 투여를 통해 270 μl를 투여받았다(인간 체중/마우스 체중 비율을 기준으로 약 54억에 해당). SLAB51은 6-OHDA 주입 전 2주 동안 매일 투여하였고, 이후 3주 동안 계속되었다. 대조군은 SLAB51만 투여받았다.

행동 테스트

Elevated body swing test

행동 테스트를 수행한 모든 연구자들은 처리 조건에 대해 눈가림되었다. EBST를 수행하기 위해, [46]에서 설명한 대로 마우스의 꼬리 기저부를 부드럽게 잡고 좌우 방향으로의 스윙을 20회까지 측정하였다.

Cylinder test

Cylinder rearing test[47]는 마우스에서 정상적인 탐색 행동 동안의 앞다리 사용을 평가하기 위해 조정되었으며, 6-OHDA 병변 전과 첫 병변 후 1, 2, 3주에 수행되었다. 각 마우스는 높이 25cm, 지름 11.48cm의 플렉시글라스 실린더에 위치시켰다. 자발적인 앞다리 접촉을 각 동물당 20회 접촉까지 기록하였다(연속되지 않은 2회). 손상된 앞다리와 손상되지 않은 앞다리의 접촉 횟수를 전체 관찰 시간 동안 관찰된 총 접촉 횟수의 백분율로 평가하였다.

형태학적 분석

실험동물은 ketamine/xylazine으로 깊이 마취한 후, 경심 관류에 의해 희생되었다. 마우스는 실온에서 인산염 완충 식염수(PBS)로 관류한 후, pH 7.6의 0.12M 인산 완충액에 4% PFA로 관류하였다. 뇌는 4% PFA에서 하룻밤 동안 보관한 후, 0.1M 인산 완충액의 30% 수크로스 용액에서 동결 보호하였다. 각 마우스의 뇌는 OCT(Sigma Aldrich, Saint Louis, USA)에 포매하였다. 블록은 "Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates"(Elsevier)에 따라 40 μm 두께의 관상 절편을 얻기 위해 냉동 절편기로 절단하였다.

면역조직화학법

자유 부유 절편을 내재성 과산화효소를 차단하기 위해 0.3% 과산화수소 용액에서 10분간 빛을 차단하여 배양하고, 실온에서 PBS 0.5% Triton X-100, 4% BSA에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 절편을 4°C에서 0.4% Triton X-100이 포함된 PBS에서 rabbit polyclonal anti-TH(1:500)와 함께 밤새 배양하였다. 대조군 절편에서는 1차 항체를 생략하였다. 실온에서 0.4% Triton X100이 포함된 PBS에서 goat anti-rabbit IgG-HRP(Sigma, B7401)와 1:100으로 2시간 배양한 후, 면역 복합체를 발색제로 3,3′-diamino-benzidine(DAB Substrate Kit for Peroxidase, Vector)을 사용하여 현상하였다. 충분한 세척 후, 절편을 탈수하고 Permount(Fisher Scientific, US)로 봉입하였다. 슬라이드는 EC3 카메라가 장착된 Leica S8 Apo 현미경으로 관찰하였다. TH+ 세포를 정량화하기 위해 각 그룹당 3개의 절편을 사용하였다.

면역형광

면역형광 실험을 위해, 절편을 "면역조직화학법" 섹션에서 보고된 대로 처리하고 4°C에서 24시간 동안 다음의 1차 항체들과 함께 배양하였다: rabbit polyclonal anti-TH(1:500), anti-NeuN(1:1000), anti DAT(1:1000), anti-Iba1(1:500), anti-GFAP(1:500). 절편을 PBS로 세척한 후 실온에서 0.4% Triton X-100이 포함된 BSA에서 2시간 동안 배양하고, 이차 항체 Alexa488 conjugated donkey anti-rabbit IgG 1:500 또는 Alexa633 conjugated donkey anti-mouse IgG 1:500 및 Alexa596 conjugated anti-chicken IgG 1:500(Life Technologies, California, USA)과 함께 배양하였다. 대조군은 1차 항체를 생략하여 수행하였다. Leica TCS SP5 공초점 현미경에서 이미지를 획득한 후 ImageJ 소프트웨어로 분석하였다. 특히, 동물당 SN의 규칙적으로 간격을 둔 5개 절편에서 절편당 평균 Iba1+ 세포 수를 확인하였다. GFAP 형광 강도를 정량화하기 위해 ImageJ 분석 소프트웨어를 사용하였으며, 각 조건당 9개의 서로 다른 시야를 분석하여(각 그룹당 n=3 마우스; 마우스당 3개 시야) 대조군 대비 형광 강도/%로 그래프에 나타내었다.

제공된 대표적인 모자이크 이미지는 모든 그림이 같은 방향으로 배향되도록 회전시켰다.

Western blotting

실체현미경 하에서 흑질과 선조체를 분리하고 다른 영역들을 pestle을 사용하여 신선하게 용해한 후, 이전에 설명한 대로[43] 단백질을 정량하였다. 10μg의 단백질을 포함하는 조직 용해물을 running buffer에서 100 mV로 80분 동안 4-13% gradient Bis-Tris gel에서 분리하였다. Semi-dry 장치(Thermo scientific, UK)를 사용하여 단백질을 PVDF 막으로 이전하였다. 막을 0.05% Tween20이 포함된 tris-buffered saline으로 세척하고, 실온에서 5% 무지방 우유로 1시간 동안 블로킹하였다. 그런 다음 막을 4°C에서 다음의 1차 항체들과 함께 밤새 배양하였다(동일한 블로킹 용액에 희석): anti p-NRF2(1:5000 Abcam, UK), anti-NFKB(1:2000 Abcam, UK) anti-p-TRKB(1:2000 Cell Signaling), anti-BDNF(1:500 Abcam, UK), anti-PPARγ(1:500, Thermo, USA) anti-HO1(1:1000 Santa Cruz, USA). 이후 1:10000 HRP-conjugated anti-rabbit IgG 또는 anti-mouse IgG와 배양하였다. West Pico luminol(Thermo scientific)을 사용하여 키트의 데이터시트에 따라 단백질 밴드를 검출하였다. Alliance Q9(Uvitec, Cambridge, UK)를 통해 화학발광 밴드를 검출하고 ImageJ 프로그램을 사용하여 "Western Blotting" in vitro 섹션에 명시된 대로 정규화하여 각 밴드의 강도를 분석하였다.

TUNEL assay

마우스 뇌의 흑질(SN) 영역을 냉동 절편기로 40 μm 두께로 절단하여 -80°C에 보관하였다. Terminal transferase-mediated dUTP nick end-labeling(TUNEL) 분석을 수행하기 위해, 절편을 4% PFA로 30분간 고정하고 실온에서 PBS로 여러 번 세척하였다. 그런 다음 절편을 차가운 에탄올/아세트산 2:1에서 5분간 배양하고 다시 PBS로 세척하였다. SN 절편에서의 신경세포 세포사멸 표지는 terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)를 기반으로 한 in situ TUNEL 기법을 사용하는 ThermoScientific(USA)의 세포사멸 검출 키트를 사용하여 수행하였으며, 공초점 현미경(Leica TCS SP5)을 통해 이미지를 획득하였다.

통계 분석

통계 분석은 PRISM 8 소프트웨어를 사용하여 t-test로 수행하였다. 통계 연구에서는 *P<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 설정하였다.

저자 기여

AC, MGC, VC가 연구를 구상하고 설계하였다. VC와 MA가 시험관 내 실험을 수행하고 분석하였다. MdA와 VC가 생체 내 실험을 완료하고 분석하였다. MdA가 공초점 이미징을 수행하였다. MA가 면역조직화학 준비에 기여하였다. MdA가 통계 분석을 수행하였다. FL과 PP가 프로바이오틱스 용해물을 준비하였다. AA가 시험관 내 PD 모델을 개발하였다. MdA가 원고의 모든 그림을 준비하였다. VC와 AC가 원고를 작성하였다. AC, AG, GD가 연구에 대한 비평을 제공하며 원고를 검토하였다. AC가 프로젝트를 감독하였다. 모든 저자가 결과를 검토하고 최종 원고에 영향을 미쳤다.

이해관계 상충

저자들은 이해관계 상충이 없음을 선언한다.


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목차 요약 SLAB51 락토바실러스 SLAB51의 구성 임신 중 임상적 중요성 안전성 고려사항 보관 및 사용 임신 중 락토바실러스의 역할 면역 체계 지원 소화 건강 합병증 예방 태아 발달 안전성 및 고려사항 연구 및 조사 프로바이오틱스 이점 개요 임상 시험 및 연구 결과 임신 중 프로바이오틱스 산전 관리에서의 적용 프로바이오틱스와 산모 장 건강 임신 중 프로바이오틱스의 이점 권장되는 프로바이오틱스 균주 식이 고려사항 안전성 및 부작용 심각한 부작용 일반적인 부작용 주의사항 자세한 내용은 https://storm.genie.stanford.edu/article/432240 를 참조하세요. 스탠포드 대학교 오픈 가상 어시스턴트 랩 생성된 보고서에는 오류가 있을 수 있습니다.   ​ 요약 SLAB51은 주로 락토바실러스 속에서 8가지 박테리아 균주를 포함하여 임신 중 산모 건강을 지원하도록 특별히 설계된 프로바이오틱스 제제입니다. 임신 중 발생하는 생리적 변화 동안 전반적인 건강에 중요한 요소인 임산부의 장내 미생물총에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다는 점에서 그 중요성이 있습니다[1][2]. 이 제제는 균형 잡힌 장내 세균총을 회복하고 유지하여 소화 건강, 면역 지원, 임신성 당뇨병 및 질 감염과 같은 합병증 예방에 기여하는 것을 목표로 합니다[3][4]. 연구에 따르면 SLAB51과 같은 프로바이오틱스는 장 건강 관리와 산모와 영아의 건강 결과 개선에 있어 임상적 관련성이 입증되었습니다. 연구들은 락토바실러스 균주가 질내 미생물군을 개선하고 변비와 감염 위험 증가와 같은 임신 관련 문제를 완화할 수 있음을 보여주었습니다[-5][3]. 또한, 새로운 증거는 산모의 장내 미생물군이 태아 발달과 장기적인 건강에 영향을 미칠 수 있음을 시사하며, 이는 임신 중 건강한 장 환경 유지의 중요성을 강조합니다[6]. 그러나 SLAB51의 이점에도 불구하고, 조산아를 포함한 취약 집단에서의 프로바이오틱스 사용에 대한 보건당국의 경고에서 특히 강조된 바와 같이 안전성 고려...
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